A polimerase de DNA é uma enzima crucial na biologia molecular, desempenhando um papel central nos processos de replicação e reparo de DNA. No laboratório, a purificação da DNA polimerase é um processo meticuloso e multi -passo que requer planejamento e execução cuidadosos. Como fornecedor de polimerase de DNA, sou bem - versado nos meandros desse processo de purificação e gostaria de compartilhar os detalhes com você.
Etapas iniciais: crescimento e lise celular
O primeiro passo na purificação da polimerase de DNA geralmente começa com células em crescimento que expressam a enzima. Geralmente, bactérias como Escherichia coli são usadas como células hospedeiras porque são fáceis de cultivar, crescem rapidamente e podem ser geneticamente projetadas para superexpressar a polimerase de DNA alvo. As bactérias são tipicamente cultivadas em um meio de cultura adequado em condições controladas de temperatura, pH e aeração. Por exemplo, E. coli é frequentemente cultivada a 37 ° C em um meio rico como Luria - Bertani (LB).
Depois que as células atingem uma densidade apropriada, elas são colhidas por centrifugação. O sedimento da célula é então ressuspenso em uma solução de buffer. Para liberar a polimerase de DNA das células, é realizada uma etapa de lise. Existem vários métodos para lise celular, incluindo métodos mecânicos (como sonicação), métodos químicos (usando detergentes como Triton X - 100) e métodos enzimáticos (usando lisozima para quebrar a parede celular bacteriana). A sonicação é uma escolha popular, pois pode afetar efetivamente as células sem causar danos significativos à enzima. No entanto, ele deve ser cuidadosamente controlado para evitar demais - aquecendo a amostra, o que pode desnaturar a polimerase de DNA.
Preparação e esclarecimento de extrato bruto
Após a lise celular, a mistura resultante contém uma variedade de componentes celulares, incluindo proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e detritos celulares. Isso é conhecido como extrato bruto. Para remover os detritos de grande escala, o extrato bruto é centrifugado em alta velocidade. O sobrenadante, que contém as proteínas solúveis, incluindo a polimerase de DNA, é cuidadosamente coletado.
Às vezes, o extrato bruto ainda pode conter uma quantidade significativa de ácidos nucleicos que podem interferir nas etapas subsequentes de purificação. Para remover esses ácidos nucleicos, uma etapa de precipitação pode ser realizada usando um composto policatial como polietilenoimina (PEI). O PEI se liga aos ácidos nucleicos carregados negativamente, fazendo com que eles precipitem, que podem ser removidos por centrifugação.
Purificação cromatográfica
A cromatografia é a pedra angular da purificação de DNA polimerase. Existem vários tipos de técnicas de cromatografia que podem ser usadas, cada uma com base em diferentes princípios de separação.
Cromatografia de Ion - troca
A cromatografia de íons - troca é frequentemente a primeira etapa cromatográfica no processo de purificação. Ele separa proteínas com base em sua carga líquida. As polimerases de DNA têm uma carga característica em um determinado pH, o que lhes permite se ligar a uma resina positivamente carregada (ânion - troca) ou carregada negativamente (cátion - troca). Por exemplo, se a polimerase de DNA tiver uma carga negativa líquida em um pH específico, pode ser usada uma resina de troca de ânion, como a celulose dietilaminoetil (DEAE). O extrato bruto é carregado na coluna e a polimerase de DNA se liga à resina, enquanto outras proteínas com diferentes cargas passam. A polimerase de DNA ligada pode então ser eluída aumentando a concentração de sal no tampão. Este método é eficaz na remoção de muitos contaminantes e pode enriquecer significativamente a polimerase de DNA na amostra.
Cromatografia em afinidade
A cromatografia de afinidade é um método de purificação altamente específico. Aproveita a interação específica entre a polimerase de DNA e um ligante imobilizado em uma resina. Uma abordagem comum é usar um sistema de tags dele. Se a polimerase de DNA tiver sido geneticamente projetada para conter uma etiqueta de histidina (sua tag), uma resina de níquel - ácido nitrilotriacético (Ni - NTA) pode ser usada. A tag His - se liga especificamente aos íons de níquel na resina, permitindo que a polimerase de DNA seja retida seletivamente na coluna. Outras proteínas que não têm a tag His - passarão pela coluna. A polimerase de DNA ligada pode ser eluída adicionando imidazol ao buffer, que compete com a etiqueta His por ligação aos íons níquel.
Outro tipo de cromatografia de afinidade que pode ser usada é a cromatografia por DNA - afinidade. Como a polimerase de DNA possui uma afinidade natural pelo DNA, uma resina contendo DNA pode ser usada. A polimerase de DNA se liga ao DNA na resina e outras proteínas de ligação não -DNA são removidas. A polimerase de DNA ligada pode então ser eluída alterando as condições do tampão, como aumentar a concentração de sal ou adicionar um DNA concorrente.
Tamanho - Cromatografia de exclusão
Tamanho - cromatografia de exclusão, também conhecida como cromatografia em gel - filtração, separa proteínas com base em seu tamanho. A coluna é preenchida com contas porosas. As proteínas menores podem entrar nos poros das contas e ter um caminho mais longo através da coluna, enquanto proteínas maiores passam pelos espaços entre as contas e eluem mais cedo. Este método é útil para remover os agregados restantes ou pequenos contaminantes de peso molecular. Também pode ser usado para determinar o peso molecular da polimerase de DNA purificada.
Purificação final e controle de qualidade
Após as etapas cromatográficas, a polimerase de DNA é geralmente altamente purificada. No entanto, ainda pode haver alguns pequenos contaminantes presentes. Uma etapa final de polimento, como cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia em fase reversa, pode ser realizada para purificar ainda mais a enzima.
Depois que a purificação é concluída, medidas rigorosas de controle de qualidade são essenciais. A pureza da polimerase de DNA pode ser avaliada usando técnicas como dodecilsulfato de sódio - eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS - página). Uma única banda no gel indica uma amostra de alta pureza. A atividade da polimerase de DNA pode ser medida usando um ensaio de síntese de DNA in vitro. A atividade específica, que é a quantidade de atividade enzimática por unidade de proteína, é um parâmetro importante para avaliar a qualidade da polimerase de DNA purificada.
Outras enzimas relacionadas e nosso portfólio de produtos
Além da polimerase de DNA, nossa empresa também oferece uma gama de outras enzimas de alta qualidade para pesquisas de laboratório. Por exemplo, temos oProteína GP41 2.0, que desempenha um papel importante nos processos de replicação do DNA. Outro produto é oExonuclease III 2.0, que é útil para estudos de reparo e modificação de DNA. E nossoSC RecA 2.0está envolvido em mecanismos de recombinação homóloga e reparo de DNA.
Conclusão
A purificação da DNA polimerase no laboratório é um processo complexo, mas gratificante. Através de um crescimento celular cuidadoso, lise, purificação cromatográfica e controle de qualidade, somos capazes de obter polimerase de DNA altamente pura e ativa. Como fornecedor de polimerase de DNA, estamos comprometidos em fornecer os produtos de maior qualidade para atender às necessidades da comunidade científica. Se você estiver interessado em nossa polimerase de DNA ou em outros produtos enzimáticos, convidamos você a entrar em contato conosco para compras e discussões adicionais. Estamos sempre prontos para oferecer conselhos e apoio profissionais para garantir que você tenha os melhores reagentes adequados para seus projetos de pesquisa.
Referências
- Sambrook, J. & Russell, DW (2001). Clonagem molecular: um manual de laboratório. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Scopes, RK (1994). Purificação de proteínas: princípios e prática. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Guia para purificação de proteínas. Academic Press.