A polarização de fluorescência (FP) é uma técnica poderosa usada em vários campos, incluindo bioquímica, farmacologia e ciências ambientais. Como fornecedor de detector de fluorescência líder, entendemos a importância de medições de FP precisas e confiáveis. Nesta postagem do blog, exploraremos como medir a polarização de fluorescência, desde os princípios básicos até as considerações práticas.
Princípios básicos de polarização de fluorescência
A polarização da fluorescência é baseada no fato de que quando uma molécula fluorescente é excitada pela luz polarizada, a luz emitida também é polarizada. O grau de polarização da luz emitida depende do movimento rotacional da molécula fluorescente durante a vida útil da fluorescência. Se a molécula estiver grande ou ligada a uma macromolécula, seu movimento de rotação será restrito e a luz emitida permanecerá altamente polarizada. Por outro lado, se a molécula for pequena e livre em solução, seu movimento de rotação é rápido e a luz emitida se torna despolarizada.
A polarização da fluorescência é quantificada pelo valor de polarização (P), que é definido como a diferença entre as intensidades dos componentes polarizados vertical e horizontalmente polarizados da luz emitida dividida por sua soma:
[P = \ frac {i _ {\ parallel} -i _ {\ perp}} {i _ {\ parallel}+i _ {\ perp}}]
Onde (i _ {\ parallel}) é a intensidade da luz emitida polarizada verticalmente e (i _ {\ perp}) é a intensidade da luz emitida em horizontalmente polarizada.
Instrumentação para medir a polarização de fluorescência
Para medir a polarização da fluorescência, você precisa de um detector de fluorescência equipado com óptica de polarização. Nossa empresa oferece uma variedade de detectores de fluorescência de alta qualidade, incluindo oDetector de fluorescência isotérmicae oDetector de fluorescência isotérmica digital, que são projetados especificamente para medições de FP precisas e sensíveis.
Esses detectores normalmente consistem nos seguintes componentes:
- Fonte de luz: Uma fonte de luz, como uma lâmpada de xenônio ou um laser, é usada para gerar a luz de excitação. A luz deve ser polarizada antes de atingir a amostra.
- Polarizadores: Os polarizadores são usados para controlar a polarização da luz de excitação e emissão. O polarizador de excitação é colocado no caminho da luz de excitação para garantir que ele seja polarizado linearmente. O polarizador de emissão é colocado em frente ao detector para medir os componentes polarizados vertical e horizontalmente da luz emitida.
- Suporte de amostra: Um suporte de amostra é usado para manter a amostra no caminho da luz de excitação. Ele deve ser projetado para minimizar a espalhamento da luz e a fluorescência de fundo.
- Detector: Um fotodetector, como um tubo fotomultiplicador (PMT) ou um dispositivo acoplado (CCD), é usado para medir a intensidade da luz emitida. O detector deve ser capaz de medir as intensidades dos componentes polarizados vertical e horizontalmente separadamente.
Configuração experimental para medições de polarização de fluorescência
As etapas a seguir estão envolvidas na criação de um experimento para medir a polarização de fluorescência:
- Selecione a sonda fluorescente apropriada: Escolha uma sonda fluorescente adequada para o seu aplicativo. A sonda deve ter um alto rendimento quântico e uma longa vida útil da fluorescência.
- Prepare a amostra: Prepare a amostra dissolvendo a sonda fluorescente em um tampão adequado. Se você estiver estudando uma interação de ligação, adicione o ligante ou a macromolécula à amostra na concentração apropriada.
- Calibre o instrumento: Calibre o detector de fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Isso pode envolver ajustar o ganho do detector, definir os comprimentos de onda de excitação e emissão e medir a fluorescência de fundo.
- Medir os valores de polarização: Coloque a amostra no suporte da amostra e meça as intensidades dos componentes polarizados vertical e horizontalmente da luz emitida. Calcule o valor de polarização usando a fórmula mencionada acima.
Fatores que afetam as medidas de polarização de fluorescência
Vários fatores podem afetar a precisão e confiabilidade das medições de polarização de fluorescência:
- Temperatura: O movimento rotacional da molécula fluorescente depende da temperatura. Um aumento na temperatura leva a um aumento no movimento rotacional e uma diminuição no valor da polarização. Portanto, é importante manter uma temperatura constante durante a medição.
- Viscosidade do solvente: A viscosidade do solvente afeta o movimento rotacional da molécula fluorescente. Um solvente mais viscoso restringe o movimento rotacional e aumenta o valor da polarização.
- Concentração da sonda fluorescente: A concentração da sonda fluorescente pode afetar o valor de polarização. Em altas concentrações, podem ocorrer com extinção e agregação da sonda, levando a medições imprecisas.
- Fotodegradação: Fotobleaching é a destruição irreversível da molécula fluorescente pela luz de excitação. Pode levar a uma diminuição na intensidade da fluorescência e afetar a medição da polarização. Para minimizar o fotodegradação, use uma luz de excitação de baixa intensidade e tempos de exposição curtos.
Aplicações de polarização de fluorescência
A polarização de fluorescência possui uma ampla gama de aplicações em vários campos:
- Descoberta de medicamentos: O FP é usado para estudar as interações de ligação entre os medicamentos e seus alvos. Ao medir o valor de polarização, você pode determinar a afinidade de ligação e a constante de dissociação do complexo de medicamentos -alvo.
- Imunoensaios: Os imunoensaios baseados em FP são usados para detectar a presença de antígenos ou anticorpos em amostras biológicas. A ligação do antígeno à sonda fluorescente marcada por anticorpos leva a uma alteração no valor de polarização, que pode ser usada para quantificar o analito.
- Análise de ácido nucleico: A FP pode ser usada para estudar a hibridação de ácidos nucleicos. A ligação de um oligonucleotídeo rotulado fluorescentemente à sua sequência complementar leva a uma alteração no valor de polarização, que pode ser usada para detectar e quantificar o ácido nucleico alvo.
Solução de problemas de medições de polarização de fluorescência
Se você encontrar problemas durante as medições de polarização de fluorescência, as seguintes dicas de solução de problemas podem ser úteis:
- Baixos valores de polarização: Se os valores de polarização forem inferiores ao esperado, verifique fatores como alta temperatura, baixa viscosidade do solvente ou alta concentração da sonda fluorescente.
- Fluorescência de fundo alto: A fluorescência de alto fundo pode ser causada por impurezas na amostra ou no solvente, ou por espalhamento de luz. Purifique a amostra e use um solvente limpo. Certifique -se de que o suporte da amostra esteja limpo e livre de arranhões.
- Medições inconsistentes: Medições inconsistentes podem ser devidas a fotodegradação, baixo alinhamento dos polarizadores ou flutuações na fonte de luz. Minimize a fotodegradação, verifique o alinhamento dos polarizadores e verifique se a fonte de luz está estável.
Conclusão
A medição da polarização da fluorescência é uma técnica valiosa para o estudo das interações de ligação e a dinâmica molecular das moléculas fluorescentes. Como fornecedor de detector de fluorescência, estamos comprometidos em fornecer instrumentação de alta qualidade e suporte técnico para ajudá -lo a alcançar medições precisas e confiáveis de FP. Quer você esteja trabalhando em descoberta de medicamentos, imunoensaios ou análise de ácido nucleico, nossoDetector de fluorescência isotérmicaeDetector de fluorescência isotérmica digitalpode atender às suas necessidades.
Se você estiver interessado em comprar nossos detectores de fluorescência ou tiver alguma dúvida sobre as medições de polarização de fluorescência, entre em contato conosco para obter uma consulta detalhada e negociação de compras. Nossa equipe de especialistas está pronta para ajudá -lo a selecionar o instrumento mais adequado para o seu aplicativo.
Referências
- Lakowicz, JR (2006). Princípios da espectroscopia de fluorescência. Springer Science & Business Media.
- Szollosi, J. & Damjanovich, S. (2004). Polarização de fluorescência: um guia prático. Nos protocolos atuais em citometria (pp. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.