Hoje, as tecnologias de diagnóstico molecular estão evoluindo em um ritmo sem precedentes, com avanços significativos nos últimos dois anos. Entre eles, as tecnologias de amplificação isotérmica ganharam mais atenção devido à sua capacidade de realizar amplificação sem a necessidade de equipamentos especializados. Existem vários métodos de amplificação isotérmica conhecidos, como Lâmpada, RPA e RAA. No entanto, hoje quero introduzir uma nova tecnologia isotérmica de amplificação-mira.
Para garantir que todos tenham uma compreensão consistente dos principais conceitos, aqui estão algumas explicações a termo:
- amplificação da polimerase recombinase (RPA): Esta é uma tecnologia de amplificação mediada por recombinase.
-Amplificação auxiliada por recombinase (RAA): um método de amplificação semelhante a recombinase mediada por recombinase.
- Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP): outra técnica de amplificação isotérmica.
- Amplificação rápida isotérmica multienzima (MIRA): uma nova tecnologia de amplificação rápida isotérmica.
Resumo e esclarecimento rápido:
Muitos podem se perguntar qual desses vários métodos de amplificação isotérmica é mais confiável e estável. Na realidade, toda tecnologia tem seus pontos fortes e limitações. No entanto, os principais fatores para a adoção bem -sucedida são a capacidade de escalar a produção de maneira confiável, baixo custo e desempenho robusto em diversas aplicações.
Agora vou analisar brevemente cada tecnologia com base no que sei:
Lâmpada (amplificação isotérmica mediada por loop):
Muitos no campo sabem que a lâmpada se originou no Japão, desenvolvida pelo Dr. Notomi em 2000 como uma nova técnica de amplificação de genes. Atualmente, a propriedade dessa tecnologia pertence à empresa japonesa Eiken Chemical Co., Ltd.
Vantagens:
- Alta sensibilidade (2-5 ordens de magnitude mais altas que os métodos tradicionais de PCR).
- Tempo de reação curto (as reações podem ser concluídas em 30-60 minutos).
- Não há necessidade de instrumentos especiais em uso clínico (embora um turbidímetro em tempo real seja recomendado durante o desenvolvimento do kit).
- Fácil de operar (seja detectando DNA ou RNA, o processo envolve a mistura da solução de reação, enzimas e modelo em um tubo de reação e depois incubando cerca de 63 graus para 30-60 minutos em um banho de água ou incubadora, com resultados observáveis pelo olho nulo).
Desvantagens:
- A alta sensibilidade pode resultar em contaminação do aerossol assim que o tubo é aberto, tornando -o inadequado para uso fora de um laboratório de PCR devido a um alto risco de falsos positivos.
- O design do primer é um desafio, tornando -o inadequado para algumas doenças, especialmente aquelas causadas por vírus com poucas sequências comuns.
- sua aplicação é relativamente limitada.
Tecnologias de amplificação isotérmica RPA e RAA:
Esses dois métodos são amplamente homólogos, com a principal diferença sendo a fonte da recombinase usada.
- A recombinase da RPA vem do bacteriófago T4.
- A recombinase de Raa é derivada de bactérias ou fungos.
Pontos -chave do princípio de trabalho:
1. Na presença de ATP, a recombinase se liga aos iniciadores, formando um complexo de ácido proteico-nucleico, que procura então o DNA alvo correspondente.
2. Depois que o primer encontra o modelo de DNA correspondente, a hidrólise ATP fornece a energia para a recombinase deixar o primer, e a DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA.
3. Ao mesmo tempo, as proteínas de ligação ao DNA de fita única (SSB) se ligam à fita de DNA deslocada para impedir a reforma da fita dupla.
Vantagens:
- A reação RPA/RAA é muito rápida, com resultados alcançáveis em cerca de 30 minutos.
- A sensibilidade pode atingir 10 cópias/μl.
- Não há necessidade de equipamentos complexos durante a amplificação.
-Desenvolvimento adicional de métodos de cromatografia em ouro baseados em sonda ou coloidal simplifica bastante a interpretação dos resultados, tornando-os adequados para uso em áreas de recursos limitados ou economicamente desfavorecidos.
Desvantagens:
- A RPA é uma tecnologia desenvolvida pela empresa britânica Twistdx, que agora pertence à Abbott, resultando em altos custos, longos ciclos de suprimento e falta de suporte técnico. Isso dificulta a aplicação em larga escala e a produção em massa na China.
- RAA é uma tecnologia puramente doméstica, mas não tem estabilidade em termos de resistência à interferência e consistência do reagente do produto. Além disso, o processo de fabricação para enzimas funcionais precisa de melhorias. Embora a tecnologia esteja no mercado há cinco anos, ela ainda não foi amplamente adotada devido a problemas de estabilidade e versatilidade.
- Tanto o RPA quanto o RAA requerem iniciadores que são 30-35 BP em comprimento. Os iniciadores mais curtos afetam a especificidade, a sensibilidade e a velocidade de amplificação, tornando o design do primer desafiador.
Mira (amplificação rápida isotérmica multienzima):
Mira é uma nova tecnologia de amplificação isotérmica introduzida em meados -2019. É homólogo para RPA e RAA.
Embora a MIRA compartilhe semelhanças com o RPA e o RAA em termos de princípios de trabalho, existem diferenças significativas na seleção de enzimas, cultivo, purificação e outros aspectos da produção em larga escala. Além disso, a equipe técnica por trás do desenvolvedor de Mira, Ampfuture, passou quase 11 anos aperfeiçoando a tecnologia. Agora está totalmente equipado para apoiar o desenvolvimento de reagentes prontos para uso, desenvolvimento personalizado, projetos de pesquisa e outros serviços personalizáveis.
Vantagens:
1. As proteínas funcionais nos reagentes MIRA são provenientes de várias enzimas, com algumas enzimas submetidas a modificações direcionadas para melhorar a eficiência do sistema enzimático do núcleo, resultando em um sistema mais abrangente.
2. Forte resistência a interferências e estabilidade. Os reagentes MIRA passam por uma extensa otimização em termos de seleção e concentração de cofator, juntamente com os processos de produção de liofilização, tornando-os mais resistentes à interferência e mais estáveis.
3. Personalização e versatilidade. Devido ao controle completo sobre a produção de proteínas funcionais e uma profunda compreensão da tecnologia, o MIRA pode ser adaptado a várias aplicações, oferecendo diferentes sistemas de reagentes e serviços de personalização personalizados.
4. Patentes proprietárias. Como o MIRA é 100% desenvolvido interno, não há risco de violação de patente durante o desenvolvimento do produto. Isso dá à Mira uma vantagem competitiva nos mercados domésticos e internacionais.
5. Um protocolo de produção completo foi estabelecido, permitindo uma produção estável em larga escala.
Desvantagens:
1. O reconhecimento de mercado ainda é baixo e mais dados e referências de diferentes campos (como taxas positivas em diferentes áreas) são necessárias para obter uma aceitação mais ampla.
2. O design do iniciador ainda segue as características do RPA ou RAA, exigindo seqüências mais longas de iniciadores ou sondas, o que pode não facilitar uma chave rápida para os usuários atuais de PCR.