O artigo propõe uma nova tecnologia de chip microfluídica para detecção multiplex de microorganismos patogênicos de camarão. A equipe de pesquisa integrou a tecnologia de amplificação de ácido nucleico rápido isotérmico multiotérmico (MIRA) e métodos de detecção de fluorescência em tempo real. Este chip microfluídico fornece uma solução rápida, sensível e eficiente para a detecção no local dos principais patógenos de camarão.
Antecedentes de pesquisa e significado
A indústria global de agricultura de camarão é um dos componentes econômicos mais importantes da aquicultura, mas a indústria há muito enfrenta ameaças de uma variedade de microorganismos patogênicos. Esses patógenos geralmente levam à morte em larga escala de camarões, afetando seriamente a produção e os benefícios econômicos. Incluindo doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND), vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética infecciosa (IHHNV), hemocitários de camarão (shivs) e insetos de pomos e pomos e pomos e pomos, etc.
Os métodos tradicionais de detecção de patógenos, como a reação em cadeia da polimerase (tecnologia de PCR), têm alta sensibilidade e especificidade, mas são complexas para operar, demorar muito tempo e confiar em equipamentos de laboratório. Essas limitações tornam a tecnologia de PCR inadequada para testes rápidos no local. A tecnologia Mira se tornou uma ferramenta de detecção molecular adequada para aplicação no local devido às suas características rápidas de amplificação sob temperatura constante e temperatura normal.
Princípio da tecnologia Mira
A tecnologia de amplificação de ácido nucleico rápido constante de constante de constante-enzima (Mira Technology) é uma tecnologia de amplificação de temperatura constante que se baseia na sinergia de múltiplas proteínas funcionais à temperatura ambiente para obter uma amplificação rápida de ácidos nucleicos. É uma tecnologia de detecção de ácido nucleico rápido verdadeiramente portátil no local. Comparado com a PCR, Mira tem mais vantagens.
Design e inovação de chips microfluídicos
Diagrama esquemático da plataforma de detecção de RPA no chip para vários microorganismos patogênicos importantes de camarão
(A) Estrutura de um chip microfluídico do tipo disco. 1: câmara de reação; 2: válvula de esfera; 3: porta de escape; 4: porta de amostragem;
(B) Vista explodida. 5: filme de vedação de calor; 6: substrato de chip.
(C) Layout detalhado dos seis conjuntos de iniciadores dentro do setor. Cada conjunto de iniciadores é pré-fixado em uma câmara de reação designada.
(D) Procedimento operacional completo na plataforma de detecção RPA no chip.
O artigo propõe um chip microfluídico integrado à tecnologia MIRA para detecção multiplex de microorganismos patogênicos de camarão. A tecnologia microfluídica pode controlar líquidos nos canais em nível de mícrons para manipulação precisa, alcançando assim a detecção eficiente e de baixo custo.
O chip possui os seguintes recursos de design -chave:
● Chip microfluídico centrífugo
O chip adota um projeto de acionamento centrífugo, usando força centrífuga para distribuir uniformemente a amostra em cada câmara de reação. Esse design simplifica o processo de operação e o operador pode concluir toda a reação simplesmente injetando a amostra.
● Detecção multi-alvo
O chip é pré-embebido com os tipos bacterianos que precisam ser detectados: necrose hepatopancreática aguda (V-AHPND), vírus da síndrome do ponto branco (WSSV), vírus da necrose subcutânea infecciosa. ) Sondas de iniciadores para cinco patógenos. Esse design pode detectar simultaneamente seis alvos de genes em uma reação, permitindo a triagem rápida de vários patógenos.
● Detecção de fluorescência em tempo real
A reação de amplificação da tecnologia Mira no chip é combinada com uma sonda fluorescente, que pode monitorar o progresso da reação de amplificação em tempo real. O projeto da sonda permite que o sinal fluorescente seja liberado apenas quando o produto de amplificação é gerado, alcançando assim a detecção quantitativa rápida e sensível.
● Sistema de reação de baixa concentração
Cada unidade de reação do chip requer apenas um volume de reação de 5 μl, o que reduz bastante o consumo de reagente. Quando todo o sistema está em execução, até quatro amostras podem ser processadas simultaneamente e cada amostra pode detectar cinco patógenos, melhorando bastante a eficiência da detecção.
Sensibilidade, especificidade e repetibilidade
O desempenho do sistema de chip inclui a detecção de simetria, ressonância e repetibilidade.
● Sensibilidade
Resultados experimentais mostram que o chip pode detectar números de cópias do gene alvo tão baixas quanto 10 cópias/μL, com sensibilidade comparável ou até mais alto que os métodos tradicionais de PCR. Essa alta sensibilidade garante que a tecnologia possa detectar indivíduos infectados precocemente em aplicações práticas, permitindo assim a triagem precoce de patógenos.
● Especificidade
O experimento realizou testes de reação cruzada em uma variedade de patógenos não-alvo, e os resultados mostraram que o chip é altamente específico para os patógenos alvo e pode distinguir com precisão vários tipos de patógenos. All tests for Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (V-AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV), Shrimp Hemacytic Iridescence Virus (SHIV) and Enterohepatitis Hepatica (EHP) The results all showed no cross-reaction, indicating that this method can effectively avoid amplificação não específica.
● Repetibilidade
Para avaliar a estabilidade do método, a equipe de pesquisa conduziu vários experimentos repetidos. Os resultados mostraram que o coeficiente de variação (valor do CV) entre diferentes experimentos foi inferior a 10%, mostrando boa repetibilidade experimental e consistência.
Aplicações e vantagens de campo
O design do chip microfluídico da tecnologia Mira oferece vantagens significativas de aplicação de campo, especialmente adequadas para detecção e monitoramento rápido de patógenos na agricultura de camarão:
● Processo de operação conveniente
Todo o processo de detecção requer apenas injetar a amostra no chip e iniciar o dispositivo de reação. Requer quase nenhuma operação manual e é adequada para os não profissionais usarem no local.
● Capacidade de resposta rápida
O sistema pode obter resultados de teste em 20 minutos, reduzindo bastante o tempo de teste. Isso é crucial para a rápida resposta de doenças em fazendas e reduzir a disseminação de patógenos.
● Capacidade de detecção multiplex
Cinco patógenos principais podem ser identificados em um teste, o que melhora bastante a eficiência da detecção e economiza custos e tempo de detecção.
Mira Prospects Technology Prospects
Embora a tecnologia de PCR tenha sido classificada há muito tempo como o padrão -ouro para a detecção de amplificação de ácido nucleico, a tecnologia Mira demonstrou grande potencial de aplicação devido à sua rápida reação a temperatura constante, operação simples e baixos requisitos de equipamento. Ao comparar com a PCR combinada com o sequenciamento de DNA, verificou -se que os resultados da detecção do chip de amplificação isotérmica são consistentes com os resultados da PCR em termos de sensibilidade e especificidade, e o tempo de reação da tecnologia Mira é significativamente reduzido. Portanto, os chips microfluídicos da tecnologia Mira são considerados uma tecnologia mais adequada para aplicações de campo, especialmente em ambientes que requerem detecção de patógenos rápida e em larga escala.
CHIPS microfluídicos baseados na tecnologia de amplificação de ácido nucleico rápido isotérmico multi-enzima (MIRA) fornece uma ferramenta eficaz para a detecção de microorganismos patogênicos na agricultura de camarões. Essa tecnologia tem as vantagens de alta sensibilidade, boa especificidade, fácil operação e velocidade rápida de detecção e possui amplas perspectivas de aplicação na prevenção e controle de doenças da aquicultura. Com desenvolvimento e otimização adicional da tecnologia, espera -se que o sistema seja aplicado à detecção de mais patógenos aquáticos, permitindo a prevenção e o monitoramento mais amplos de doenças.
Os resultados da pesquisa fornecem um método confiável de detecção precoce para a indústria da aquicultura, que pode efetivamente reduzir o risco de surtos de doenças, melhorar a eficiência da produção e a produção das fazendas e estabelecer uma base técnica para o desenvolvimento sustentável da indústria da aquicultura.