《Estabelecimento de um Micropterus salmoides Rhabdovírus Método de detecção de rabdovírus com base no CRISPR CAS13A System Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie Bassagem Negra, Baixa Bassilt Bassin. Journal Chinese of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus salmoides, também conhecido como California Bass ou American Black Bass, é um peixe de água doce nativo da América do Norte. Nos últimos anos, tornou -se um importante peixe cultivado em todo o mundo devido à sua alta demanda de mercado: o Micropterus salmoides tem carne firme, poucos ossos, sabor delicioso, rica nutrição, especialmente alta proteína e baixa gordura, que atende à demanda dos consumidores por alimentos saudáveis. Portanto, o preço de mercado é relativamente alto e é frequentemente usado no mercado de catering de ponta. Crescimento rápido: Micropterus salmoides cresce rapidamente e geralmente pode atingir as especificações de commodities nos meses 6-8. É adequado para criação de curto ciclo e pode rapidamente realizar retornos de investimento. Forte resistência a doenças: em comparação com outros peixes cultivados, o Micropterus salmoides tem forte adaptabilidade ao meio ambiente, menos surtos de doenças em larga escala e reduz os riscos de criação. Criação ecológica: o baixo largemouth pode ser misturado com outros peixes de água doce, como carpa prateada e carpa de grama, o que ajuda a alcançar o equilíbrio ecológico da lagoa e maximizar a utilização de recursos, melhorar ainda mais a eficiência da criação e outros fatores. É recebido por clientes e agricultores de aquicultura, e sua escala de criação cresceu rapidamente nos últimos anos.
Embora o Micropterus salmoides seja relativamente resistente a doenças, eles ainda podem sofrer de algumas doenças sob más condições de criação. Entre eles, o Rabdovírus de Micropterus salmoides (MSRV) é extremamente prejudicial: foi descoberto pela primeira vez na Flórida, EUA, em 1991. O vírus foi detectado inicialmente em populações de baixo de Largemouth selvagens e depois se espalharam gradualmente para muitos lagos e reservatórios de água doce.
Sintomas clínicos de peixe doente
R: Baixo de largemouth saudável, a flecha indica o saco de gema; B: Baixo do Largemouth doente, a flecha indica o saco de gema.
A fonte de transmissão é frequentemente fritada infectada ou peixes adultos, corpos de água poluídos e peixes selvagens que carregam o vírus; Esse vírus pode ser transmitido através de contato direto, excreção fecal e corpos d'água e é mais provável que ocorra sob baixa qualidade da água ou condições de criação de alta densidade. difusão. O vírus pode causar letargia, errante, inchaço abdominal e distorção corporal em peixes juvenis, além de induzir úlceras necróticas e sangramento de vários órgãos. Uma vez infectado, a taxa de mortalidade excede 90%.
Sintomas clínicos de micropterus salmoides infectados artificialmente
A: baixo saudável largemouth; B, C, D: Bass largemouth infectados artificialmente.
Todos os anos, mais de 30% dos fritados de Micropterus salmoides são perdidos devido à MSRV. Atualmente, os métodos de tratamento e detecção para o vírus ainda são imaturos e não há medicina específica para tratá -lo. Portanto, é muito necessário detectar o vírus a tempo antes da infecção e tomar medidas preventivas eficazes, o que pode reduzir as perdas no processo de criação em certa medida;
Além disso, é difícil realizar a detecção no local sem equipamentos de detecção complexos com a tecnologia de detecção existente. Diante desse desafio, a equipe de pesquisa da Universidade Agrícola do Sul da China desenvolveu um novo método de detecção combinando Mira com o System CRISPR. Esse método possui forte especificidade, alta sensibilidade e operação simples, o que melhora bastante a eficiência de detecção do MSRV e também ajuda a detectar a MSRV o mais cedo possível e tomar medidas de prevenção e controle.
Triagem de combinação de primers mira
Dois pares de iniciadores de Mira diferentes foram utilizados para amplificar o fragmento de genes que contêm a sequência alvo, e os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em gel de agarose. O gráfico de eletroforese estava localizado na posição de 100 pb, e bandas brilhantes apareceram nas três faixas, indicando que havia produtos de amplificação não específicos. As bandas de destino amplificadas a 250 pb nas faixas 2 e 3 foram analisadas quantitativamente pelo software Image J, e os resultados da análise quantitativa foram expressos pelo "valor cinza". Nos resultados da análise, pode -se concluir que quanto menor o valor cinza, maior a taxa de utilização do iniciador, ou seja, maior a eficiência da amplificação de ligação específica do iniciador.
Os resultados mostraram que a eficiência de amplificação de ligação específica foi alta quando o par de iniciadores Mira-F2/R2 foi usado.
Mira Primer Trifesing Eletroforese Gel Image e Análise de valor cinza
um. Eletroforese Lane M: marcador de DNA de 2000 pb; Eletroforese pista 1. Amplificação negativa da amostra de DNA; A faixa de eletroforese 2. Mira-F1/R1 Par de iniciadores amplifica o fragmento de destino (224 pb, como mostrado na caixa); eletroforese pista 3. Mira-F2/R2 Par de iniciadores amplifica o fragmento de destino (255 pb, como mostrado na caixa); b. Análise de valor cinza da banda (como mostrado na caixa)
Sistema de detecção CRISPR/CAS13A
Após a reação do sistema de detecção CRISPR/CAS13A, é irradiada com luz ultravioleta para observar os resultados.
Diagrama de brilho do sistema de detecção CRISPR/CAS13A
1-3. Todo o sistema com padrão de RNA adicionado; 4. Nenhum crRNA adicionado; 5. Nenhuma proteína Cas13A adicionada; 6. Nenhuma sonda de repórter ssRNA adicionada; 7. Controle negativo
Sistema de reação ideal CRISPR/CAS13A-MSRV
Realizamos experimentos usando padrões de RNA e RNA de amostra amplificada. A velocidade de posicionamento do RNA alvo foi melhor com o crRNA2 do que com crRNA1. O crRNA1 apresentou um sinal de fluorescência final mais forte que o crRNA2. O uso misto de crRNA 1+ crRNA2 em proporções iguais pode combinar as vantagens de ambos e obter melhor eficiência da reação.
Otimizando as condições de reação de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV e os resultados da detecção
um. Comparação dos resultados da detecção do RNA padrão usando crRNA com diferentes seqüências de espaçadores;
b. Comparação dos dados do sinal de fluorescência do RNA padrão detectado pelo sistema de detecção em diferentes temperaturas;
c. Comparação dos dados do sinal de fluorescência do RNA padrão detectado usando sondas repórter de RNA com diferentes concentrações;
d. Comparação dos resultados da detecção do RNA padrão detectado usando complexos de sonda Cas13a/crRNA com diferentes taxas de concentração;
Para explorar o efeito da temperatura da reação no sistema de detecção, foram definidas diferentes temperaturas de reação de 31 graus, 34 graus, 37 graus e 41 graus. A temperatura ideal da reação do sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV foi de 37 graus.
Para explorar o efeito da concentração da sonda do repórter ssRNA no sistema de detecção, dentro da faixa de teste, a intensidade da fluorescência foi positivamente correlacionada com a concentração da sonda repórter do ssRNA. O efeito de detecção da concentração da sonda do repórter ssRNA não foi muito diferente em 500-700 nmol/l. Considerando os problemas econômicos reais, a concentração ideal da sonda do repórter do ssRNA foi de 500 nmol/L.
Para explorar o efeito de diferentes taxas de concentração de reação Cas13a e crRNA no sistema de detecção, quando a razão de Cas13a: crRNA foi de 4: 1 e 3: 1 com base na proporção de 100 nmol/L por porção, Cas13A atingiu a saturação; Quando a quantidade de Cas13a era constante, a intensidade do sinal de fluorescência não foi positivamente correlacionada com o aumento da quantidade de crRNA. Portanto, quando a proporção de Cas13a para crRNA é de 2: 1, o sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV pode atingir a atividade máxima de detecção.
Avaliação de sensibilidade
Para explorar a concentração mínima de detecção de MSRV pelo sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV, o padrão de RNA foi diluído 10 vezes em uma série e detectado pelo sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV. O sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV pode detectar pelo menos 100FM do RNA de destino MSRV. Quando a concentração de RNA alvo é menor que 100FM, o sinal de fluorescência detectado pela máquina não é significativamente diferente do controle em branco. Portanto, o sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV pode detectar pelo menos 100fm de ssRNA MSRV.
Avaliação da especificidade do sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV para MSRV
Teste de amostra
Para amostras de peixes doentes com sinais óbvios de doenças coletadas das fazendas de robalo, verificamos se o patógeno infectado pelo peixe doente era MSRV. Utilizamos iniciadores específicos para a sequência de proteínas do capsídeo MSRV para amplificação por PCR e enviamos as bandas correspondentes no diagrama de eletroforese para teste. Após a comparação, confirmamos que era MSRV.
Confirmação de informações de sequência MSRV
um. Amplificação por PCR de 228 pb de banda de produtos de primers MSRV; b. Sequência de proteínas do capsídeo MSRV em comparação com o NCBI, as sequências em negrito são os locais de ligação do iniciador a montante e a jusante, e as áreas sombreadas são locais alvo para ligação ao crispr/cas13a-msrv crRNA1
As amostras de peixes doentes infectadas com MSRV foram pré -tratadas e pré -amplificadas para o RNA viral e depois testadas com o grupo controle negativo. Ao mesmo tempo, o cDNA das amostras foi extraído para comparação com o qPCR convencional. As amostras positivas (nº 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 e 15) detectadas pelo sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV foram as mesmas que os resultados do qPCR convencional, onde o valor CQ do qPCR estava entre 18 e 25; Enquanto o número do ciclo limite de amostras negativas (nº 1, 2, 4, 5, 9, 10 e 11) foi maior que 38, indicando que as amostras não carregavam o vírus MSVR. Em resumo, os dados de detecção do sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV e o RT-QPCR convencional foram consistentes, indicando que o sistema de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV é viável e pode substituir os métodos de detecção convencionais e complicados originais em certa medida.
Gráfico de comparação vertical dos dados de detecção de qPCR de amostra com qPCR e CRISPR
um. Detecção de qPCR do diagrama de números de limiar de amostra clínica da MSRV; O número de ciclo de amostra detectado foi comparado com o número do ciclo de referência negativo usando análise de teste t (** P<0.01);
b. Cas13a combinado com a detecção MIRA do diagrama de fluorescência da amostra clínica da MSRV; O valor de fluorescência da amostra detectado foi comparado com o valor negativo de fluorescência de referência usando análise de teste t (** P<0.01)
Em resumo, o método de detecção CRISPR/CAS13A-MSRV estabelecido neste estudo não requer instrumentos experimentais caros, tornando a detecção no local rápida, precisa e conveniente. Portanto, se esse método de detecção for usado para descobrir oportunamente a MSRV no processo de criação real e tomar medidas direcionadas e eficazes, poderá reduzir bastante as perdas causadas por doenças no processo de criação. Além disso, esse método de detecção é rápido, altamente sensível e específico e possui ótimas perspectivas de aplicação e promoção.