《Desenvolvimento de um romance CAS13A/CAS12A mediado"um pote" dual Ensaio de detecção para culturas geneticamente modificadas Express
As culturas geneticamente modificadas têm sido amplamente plantadas em todo o mundo, e muitos países melhoraram gradualmente suas medidas regulatórias para garantir a segurança de culturas geneticamente modificadas. O desenvolvimento de métodos de detecção genética rápida e precisa no local é muito importante para a agricultura e a biossegurança e pode aliviar as preocupações do público sobre produtos geneticamente modificados.
Neste estudo, o grupo de pesquisa desenvolveu uma nova reação de um pote -- Mira dupla detecção combinada com o duplo CRISPR (método MR-DCA) para a detecção simultânea de CAMV35s e os alvos genéticos de NOS em culturas geneticamente modificadas, fornecendo um método de detecção simples e eficiente para a detecção de Crops geneticamente modificados.
Métodos experimentais
O produto duplo Mira é analisado pelo sistema duplo CAS13A e CAS12A para gerar dois sinais independentes que não interferem entre si e, em seguida, a cor fluorescente é lida por um instrumento de iluminação ou por uma tira de teste com duas linhas T para obter leitura de canal duplo. Todo o processo é concluído em menos de 35 minutos, com um limite de detecção tão baixo quanto 20 cópias.
(Princípio da detecção de MR-DCA de CAMV35s e NOS)
Todo o experimento é dividido em três etapas: amplificação Mira, reação CRISPR e dois métodos de interpretação de resultados.
O gene CAMV35S é usado como alvo do CAS13A, e o gene NOS é usado como alvo do CAS12A. Dois pares de iniciadores Mira foram projetados, respectivamente. O sistema CAS13A reconhece apenas o RNA, portanto a região do iniciador direto é projetada, que contém um promotor T7 para a transcrição e ativação subsequente de Cas13a. Um PAM é adicionado ao gene NOS. As adições acima garantem que as proteínas Cas13a e Cas12a possam se ligar aos seus respectivos crRNAs, e não há interferência ou reação cruzada entre os dois sistemas.
Situação experimental
Sensibilidade e especificidade
A amostra foi diluída em um gradiente para testar a intensidade da fluorescência da reação Mira. Verificou -se que a intensidade da fluorescência ainda poderia ser detectada em uma concentração de amostra de 20 μl. A concentração de 20 μL foi finalmente selecionada para o experimento.
(Diferentes concentrações de amostra e tiras de teste são usadas para desenvolvimento de cores e cálculo de quantificação de intensidade)
Para avaliar ainda mais a especificidade do MR-DCA, a equipe de pesquisa testou amostras mistas de animais não transgênicos e plantas não transgênicas. Os resultados mostraram que apenas amostras transgênicas contendo CAMV35s e NOS apresentaram altos sinais de fluorescência, enquanto a intensidade da fluorescência de outras amostras estava próxima da do controle negativo. O MR-DCA pode ser usado como uma plataforma específica de detecção de ácido nucleico de alvo duplo.
24 amostras de culturas foram testadas por MR-DCA. Entre eles, 1, 2, 15, 16, 21 e 22 são milho transgênico contendo o promotor CAMV35S. 7, 8, 23 e 24 são arroz transgênico resistente à doença contendo terminador de NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 e 18 são soja transgênica que contêm o promotor CAMV35S e o NOS Terminator.
(Resultados do teste de 24 amostras)
Reação rápida
O tempo de reação é um fator importante na detecção no local. A equipe de pesquisa observou que os sinais de fluorescência de FAM e Hex poderiam ser detectados por um instrumento de fluorescência quando o tempo de reação foi de 10 minutos. Mira combinada com a reação CRISPR também observou a fluorescência amarela após 15 minutos.
(Sinal de fluorescência em diferentes tempos de reação da Mira)
(O desenvolvimento de cores das tiras de teste em diferentes tempos de reação Mira e o cálculo da quantificação de intensidade)
Conclusão experimental
Os resultados experimentais mostraram que o MIRA duplo tem boa especificidade e pode obter com precisão os produtos de amplificação dos CAMV35s e NOS. Os sistemas CAS13A e CAS12A reagem de forma independente, sem interferir entre si. O teste MR-DCA pode detectar com precisão 20 cópias a uma temperatura baixa de 35 minutos, o que tem grande valor na detecção de culturas geneticamente modificadas no campo.
Informações do artigo
Nome do diário: 《Journal of Advanced Research Express
Título do artigo: 《Desenvolvimento de um novo ensaio de detecção dupla mediado por Cas13a/Cas12a para culturas geneticamente modificadas
Fator de impacto: 11.4
Equipe de pesquisa: Wang Xiaofu, Academia de Ciências Agrícolas de Zhejiang