Detecção visível e rápida de chaphamaparvovírus felino usando amplificação rápida isotérmica multienzimática e ensaio de tira reagente de fluxo lateral
Jornal:Fronteiras em Microbiologia Celular e de Infecção
Fator de Impacto:4.6
Chapamaparvovírus felino(FeChPV)é um novo parvovírus, detectado pela primeira vez em gatos diarréicos no Canadá em 2019. Sua patogenicidade e características moleculares permanecem obscuras e exibe diversidade genética e hospedeira, exigindo investigação epidemiológica adicional. Atualmente, não existe um método padronizado para detecção de FeChPV.
Método de amplificação rápida isotérmica multienzimática-vareta de fluxo lateral (MIRA-LFD)tem sido utilizado com sucesso na detecção de diversos vírus, oferecendo vantagens como rapidez, simplicidade e dispensa de instrumentos de precisão. A equipe de pesquisa estabeleceu um método LFD-MIRA adequado para FeChPV para enfrentar desafios na detecção clínica de base. Sem depender de instrumentos de precisão,o método MIRA-LFD concluiu a detecção de FeChPV a 37 graus em 20 minutos e não mostrou reatividade cruzada-com outros vírus. O limite de detecção foi de 32,3 cópias/μL,10 vezes maior que o método PCR. Além disso, o método MIRA-LFD detectou 29 amostras positivas para FeChPV-entre 417 gatos diarréicos, com uma taxa de positividade ligeiramente superior à do método nested PCR. Esses resultados indicam que o método MIRA{7}}LFD estabelecido para detecção de FeChPV é um método eficiente, econômico, confiável e simples, contribuindo para a prevenção e controle precoce da infecção por FeChPV.
1. Métodos Experimentais
Amostras clínicas:As amostras de esfregaços retais utilizadas neste estudo foram coletadas de 632 gatos (incluindo 417 com diarreia e 115 gatos saudáveis) e 474 cães (incluindo 342 com diarreia e 132 cães saudáveis) em clínicas veterinárias nas províncias de Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang e na Região Autônoma da Mongólia Interior entre 2022 e 2024.
Amplificação de Ácido Nucleico:O ácido nucleico do DNA extraído foi adicionado ao sistema MIRA. A recombinase e os iniciadores formaram um complexo; com a ajuda de proteínas auxiliares e proteínas de ligação-de fita simples, eles invadiram o modelo-de DNA de fita dupla. Primers ligados a regiões complementares homólogas para formar uma região D-loop, enquanto a recombinase se desmonta do complexo. A polimerase ligou-se à extremidade 3' dos primers e iniciou a síntese de DNA, amplificando exponencialmente a região alvo no modelo. Esse processo ocorreu de forma rápida e eficiente, conseguindo assim uma amplificação ultra{8}}rápida do fragmento de destino em apenas 15 minutos.
Desenvolvimento da cor da tira de teste:O produto de amplificação de ácido nucleico foi diluído 1:10, aplicado na tira teste e os resultados foram lidos após 5 minutos.
Todo o processo, desde a amplificação do ácido nucleico até o desenvolvimento da cor da tira de teste, levou apenas 20 minutos.
Amp-futuros produtos biológicos foram usados no experimento:
No estudo, quatro conjuntos projetados de combinações específicas de-sondas iniciadoras foram selecionados. Tanto a eletroforese em gel de agarose quanto as tiras de teste de ácido nucleico foram utilizadas para apresentação dos resultados. Todas as quatro combinações de-sondas iniciadoras puderam detectar o vírus FeChPV. De acordo com os resultados da eletroforese em gel de agarose, a combinação FeChPV-4 apresentou a banda alvo mais brilhante, portanto esta combinação foi selecionada para testes subsequentes.
De acordo com os resultados da electroforese em gel de agarose, a amplificação durante 5, 10, 15 e 20 minutos produziu a banda alvo. A intensidade da banda alvo atingiu o pico aos 15 minutos de amplificação, estabelecendo 15 minutos como o tempo de reação ideal para este ensaio. A amplificação a 36 graus, 37 graus, 38 graus, 39 graus e 40 graus produziu a banda alvo, com a banda mais brilhante observada a 39 graus, estabelecendo 39 graus como a temperatura de reação ideal para este ensaio.
(Figura A: 1: Amplificação 5min; 2: Amplificação 10min; 3: Amplificação 15min; 4: Amplificação 20min) (Figura B: 1: Amplificação 36 graus; 2: Amplificação 37 graus; 3: Amplificação 38 graus; 4: Amplificação 39 graus; 5: Amplificação 40 graus)
2. Desempenho de detecção
Sensibilidade:
(Figura A: resultados MIRA apresentados usando eletroforese em gel de agarose)
(Figura B: Resultados de Nested PCR apresentados usando eletroforese em gel de agarose)
(Figura C: Resultados MIRA apresentados usando tiras de teste de ácido nucleico)
As amostras foram submetidas a diluições seriadas de 10 vezes a partir de 3,23×10⁶ cópias/μL. Nested PCR com eletroforese em gel de agarose pode detectar de forma estável 3,23×10² cópias/μL; MIRA com eletroforese em gel de agarose e MIRA com tiras de teste de ácido nucleico puderam detectar de forma estável 3,23×10¹ cópias/μL.
O método MIRA apresentou sensibilidade consistente usando dois formatos diferentes de apresentação de resultados, e a sensibilidade do método MIRA foi superior à do nested PCR.
Especificidade:
(1: FeChPV, chaphamaparvovírus felino; 2: FPV, vírus da panleucopenia felina; 3: FeAstV, astrovírus felino; 4: FBoV, bocavírus felino; 5: CachaV, chaparvovírus canino; 6: controle negativo)
O recém-criado método MIRA-LFD detectou apenas FeChPV e não mostrou reatividade-cruzada com outros vírus de referência, indicando boa especificidade.
3. Resumo do estudo
Este estudo estabeleceu um método MIRA{0}}LFD para detectar FeChPV sem a necessidade de instrumentos de alta-precisão. Por ser um método de detecção eficiente, econômico e confiável, com alta sensibilidade e especificidade, o método MIRA{3}}LFD é mais adequado para detecção clínica, fornecendo suporte técnico para a prevenção e controle precoce da infecção por FeChPV.
4.AMP-BIOTECNOLOGIA DO FUTURO
A amplificação rápida isotérmica multienzimática de ácido nucleico MIRA é uma tecnologia que realmente permite-detecção rápida no local.
A tecnologia MIRA é baseada no mecanismo de reparo de recombinação genética in vivo, contando com a ação sinérgica de múltiplas proteínas funcionais à temperatura ambiente para alcançar uma amplificação de ácido nucleico rápida (5-20 min), sensível, específica e segura à temperatura ambiente (25 graus –45 graus). Devido à natureza isotérmica da tecnologia MIRA, ela possui baixos requisitos de equipamento e operação simples. Por meio de dispositivos portáteis miniaturizados, ele pode ser aplicado em testes de linha de frente em diversos cenários de aplicação, trazendo testes de ácido nucleico rápidos e precisos para ambientes como POCT, testes domésticos, campos agrícolas e-a aplicação da lei no local. Com base na tecnologia MIRA, a Amp-future Biotech desenvolveu uma série de-produtos de testes rápidos no local, incluindo agentes de liberação rápida de ácidos nucleicos, reagentes isotérmicos de amplificação rápida de ácidos nucleicos, tiras de teste de ouro coloidal e equipamentos portáteis miniaturizados, criando uma solução geral para-testes moleculares rápidos no local. Além disso, a tecnologia MIRA da Amp-future oferece vantagens de aplicação quando combinada com tecnologia CRISPR, NGS, SNP, microfluídica e muito mais.
Além da série de-produtos de testes rápidos no local mostrados acima, a Amp-future Biotech também oferece:
Reagentes de pesquisa:Fornecer matérias-primas reagentes e suporte técnico para pesquisas científicas básicas, bem como referências bibliográficas de projetos.
Produção OEM:Capaz de produzir de forma independente produtos acabados de alta-pureza e alta{1}}atividade durante todo o processo, alcançando produção em-escala industrial.
Desenvolvimento comissionado do projeto:Informações de sequência e resultados de análise de alinhamento de sequência, primer do projeto-projeto e síntese de sonda, síntese e amostras de plasmídeos do projeto, relatórios e resultados do projeto, etc.
Para mais informações, entre em contato.