Para obter amplificação de sinal para vestígios de ácidos nucleicos virais e fornecer substratos suficientes para Cas14a, desenvolvemos aMIRA (amplificação rápida isotérmica multienzimática assimétrica) baseada em MIRA. O sistema aMIRA-Cas14a resultante oferece as seguintes vantagens principais:
1. A estequiometria otimizada do primer permite que o MIRA produza preferencialmente em excesso o ssDNA, que serve como substrato direto para Cas14a. Ao ajustar a proporção do iniciador direto-para{4}}reverso para 20:1, o sistema gera ssDNA suficiente para ativar a atividade de clivagem independente-do PAM de Cas14a, que reconhece e cliva especificamente o ssDNA.
2. A integração única de MIRA e CRISPR-Cas14a elimina riscos de contaminação cruzada.
3. O MIRA aumenta significativamente a sensibilidade de detecção, permitindo a detecção de ácidos nucleicos virais de abundância ultrabaixa.
4. aMIRA-Cas14a mantém alta especificidade, evitando falsos positivos causados por amplificação inespecífica.
Em última análise, a integração única do MIRA e do CRISPR-Cas14a elimina os riscos de contaminação e alcança uma sinergia perfeita entre os pontos fortes do MIRA e o sistema CRISPR-Cas14a. Isto resolve o desafio de toda a indústria de incompatibilidade entre a amplificação isotérmica e os sistemas CRISPR, representando o principal avanço tecnológico da plataforma MaC14a. O sistema aMIRA{7}}Cas14a alcança uma melhoria de 1.000 vezes na sensibilidade, garantindo uma amplificação específica. Combinado com o reconhecimento específico da sequência do Cas14a, isso fornece validação de especificidade de camada dupla, sem reatividade cruzada contra vírus não-alvo ou amostras saudáveis-abordando outro ponto problemático do setor: a tendência para falsos positivos.
Os reagentes isotérmicos de amplificação rápida multienzimáticos MIRA usados neste estudo foram fornecidos pela Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Além do excelente desempenho dos reagentes, a Amp‑future Biotech também oferece uma equipe de suporte técnico profissional e de rápida resposta.
MIRA demonstra forte compatibilidade com chips microfluídicos{0}}baseados em centrífugas desenvolvidos para aplicações de pesquisa e diagnóstico:
1.Sistema de reação miniaturizado, adequado para câmaras de reação de micro-volume características de chips microfluídicos;
2. Capacidade de detecção multiplex em uma única execução;
3.Compatibilidade com dispositivos portáteis, fluxos de trabalho suaves da amostra ao resultado.
projetamos um dispositivo portátil integrado de "amostra-entrada,{1}}resposta" de ponto-de-teste de atendimento (POCT) otimizado para implantação em campo, conforme ilustrado na Figura. 4A. O protótipo compacto (23 cm (C) x 21 cm (L) x 14 cm (A), massa total de 12,5 kg) alcança portabilidade excepcional. Os principais componentes do sistema incluem um servo motor de alta-precisão para controle rotacional preciso e uma unidade de aquecimento de ar para regulação de temperatura. Um módulo de detecção óptica integrado, posicionado abaixo do chip, facilita a excitação e medição de fluorescência, garantindo alta sensibilidade e precisão na detecção. O dispositivo portátil é equipado com um sistema operacional Android integrado, oferecendo uma interface-amigável onde os operadores podem selecionar arquivos de operação pré-programados contendo parâmetros detalhados, como tempo de reação e temperatura. Os resultados e conclusões são exibidos em-tempo real em uma tela LCD, permitindo a rápida aquisição de informações. Além disso, o sistema incorpora um módulo de comunicação sem fio que suporta transmissão de dados-em tempo real para dispositivos móveis ou servidores em nuvem, integrando-se com algoritmos de inteligência artificial para interpretação e análise imediata dos resultados dos testes.
