No campo do diagnóstico molecular, a reação em cadeia da polimerase (PCR) há muito é considerada o padrão ouro para a detecção de ácidos nucleicos. Nos últimos anos, as tecnologias de amplificação isotérmica, representadas pela amplificação da polimerase recombinase (RPA), ganharam atenção crescente devido à sua velocidade, simplicidade e adequação para testes-no local.
Embora tanto a PCR como a RPA sejam métodos de amplificação de ácidos nucleicos, diferem significativamente nos princípios de funcionamento, requisitos de equipamento e cenários de aplicação, tornando cada tecnologia adequada para diferentes necessidades de diagnóstico.
1. Princípios Básicos: Ciclagem Térmica vs. Amplificação de Temperatura-Constante
PCR é um processo bioquímico capaz de amplificar uma única molécula de DNA em milhões de cópias em um curto período de tempo. A reação depende de ciclos térmicos repetidos e consiste em três etapas principais:
1.Desnaturação (90–95 graus) – O DNA de fita dupla-é separado em fitas simples.
2.Annealing (55–65 graus) – Os primers ligam-se às sequências alvo.
3.Extensão (72 graus) – A DNA polimerase sintetiza novas cadeias de DNA.
Por meio desses ciclos-de temperatura controlada, o DNA alvo é amplificado exponencialmente com alta precisão. No entanto, a PCR requer instrumentos de ciclagem térmica complexos e normalmente leva de 1 a 2 horas para ser concluída.
Em contraste, o RPA opera a uma temperatura constante de 37–42 graus, permitindo a rápida amplificação do ácido nucleico sem ciclagem térmica. A tecnologia depende da ação coordenada de proteínas recombinases, proteínas de ligação de-fita simples de DNA-e DNA polimerase-deslocadora de fita para alcançar amplificação de alvo altamente específica sob condições isotérmicas.
A DNA polimerase usada na RPA tem atividade de deslocamento de fita, mas não possui atividade de exonuclease 5'→3'. Durante a amplificação, os iniciadores externos estendem-se ao longo da cadeia modelo. Quando encontram regiões de fita dupla sintetizadas a partir de primers internos, a polimerase não consegue degradar a fita a jusante e, em vez disso, a desloca, gerando novos produtos de amplificação.
Toda a reação é concluída sob temperatura constante, eliminando a necessidade de instrumentação complexa e permitindo verdadeiros testes-de-atendimento e de campo-. Ao incorporar a transcriptase reversa, o RPA também pode ser aplicado à detecção de alvos de RNA.
Os resultados da amplificação podem ser analisados usando vários formatos de leitura, incluindo detecção de endpoint, monitoramento de fluorescência-em tempo real, ensaios de fluxo lateral e podem ser integrados ainda mais com sistemas CRISPR-Cas, microfluídica ou sequenciamento de próxima-geração (NGS) para desenvolvimento de ensaios avançados.
Cenários de aplicação: precisão de laboratório versus testes rápidos-no local
A PCR tornou-se uma das tecnologias de diagnóstico molecular mais valiosas e continua a ser o padrão ouro para testes de ácidos nucleicos.
Graças à sua alta precisão,{0}}benefício e escalabilidade, o PCR é amplamente utilizado em diagnósticos clínicos, laboratórios centralizados, instituições de pesquisa e programas de triagem em grande-escala, onde infraestrutura e pessoal treinado estão prontamente disponíveis.
A RPA, por outro lado, oferece vantagens claras em diagnósticos rápidos-no local. Com amplificação concluída em apenas 20 minutos, requisitos mínimos de equipamento e operação simples, o RPA é ideal para.
- Cuidados de saúde primários e ambientes de emergência
- Alfândega e inspeção de fronteiras
- Triagem de campo de doenças de animais e plantas
- Testes ambientais e de segurança alimentar
Quando combinado com dispositivos portáteis e tiras de fluxo laterais, o RPA permite testes moleculares rápidos e confiáveis fora dos laboratórios tradicionais.
MIRA (amplificação rápida isotérmica multienzimática)é a tecnologia de amplificação isotérmica proprietária da Amp Future. Pertence à mesma família técnica do RPA e é inspirado em mecanismos naturais de recombinação e reparo do DNA, utilizando múltiplas enzimas funcionais para obter rápida amplificação de ácidos nucleicos sob temperatura constante.
MIRA emprega um sistema coordenado de cinco enzimas principais, incluindo helicase, recombinase, proteína de ligação de-fita simples-de DNA e DNA polimerase, para permitir:
- Ampla faixa de temperatura operacional: 25 graus –45 graus
- Amplificação rápida: resultados em 20 minutos
- Alta sensibilidade e especificidade
- Maior segurança e redução do risco de contaminação
MIRA é uma tecnologia de amplificação de ácido nucleico projetada especificamente para testes reais no-local e no-ponto-de atendimento.
Com base na plataforma MIRA, a Amp Future desenvolveu um portfólio abrangente de produtos para POCT molecular rápido, incluindo:
Agente de liberação rápida de ácido nucleico:
O ácido nucleico amplificável é obtido em 5 minutos à temperatura ambiente; baixa inibição, permitindo carregamento completo da amostra de até 50 μL; transporte e armazenamento em temperatura ambiente, sem necessidade de proteção contra luz.
Reagente isotérmico de amplificação de ácido nucleico:
Amplificação concluída em 5 a 20 minutos, rápida e eficiente; diversas formas de reagentes (pó liofilizado, microesferas liofilizadas, etc.); vários métodos de apresentação de resultados (eletroforese, fluorescência, tiras de teste).
Dispositivos portáteis miniaturizados:
Detectores isotérmicos digitais, ferramentas de teste de bolso, fáceis de segurar com uma mão, equipados com um banco de energia, libertando você das restrições do laboratório e trazendo testes precisos de ácido nucleico para o campo.
Tiras de teste simples/múltiplas:
Otimizado com base na metodologia MIRA para melhor compatibilidade; combinado com a tecnologia MIRA, destacando a conveniência.
Analisador de amplificação de ácido nucleico totalmente automatizado:
Requer apenas uma operação de carregamento de amostra para detecção totalmente automatizada; limite de detecção até uma única cópia; a amplificação isotérmica e o nivelamento automático reduzem o risco de contaminação.
Pacote-de testes rápidos no local:
Testes-no-local, a qualquer hora, em qualquer lugar, tudo em um único pacote; completa o teste em 30 minutos, preciso e sensível.
Para mais informações sobre produtos ou soluções, não hesite em contactar-nos.